【转移贴】狂犬病实验室检测技术指南

cao1976

原贴由birdflu发表于 2009-10-23 21:35
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狂犬病实验室检测技术指南
1、实验室条件及生物安全操作要求
（1）        从事狂犬病临床和实验室的工作人员需要暴露前免疫，所有意外暴露于狂犬病毒时必需立即报告本部门负责人。
（2）        操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2或P3（实验室固定毒在P2，病人或动物分离的街毒在P3）生物安全实验室内进行。
（3）        当实验室对接收到的动物标本进行操作时，必须在P3以上条件的专业实验室中进行。没有安全实验室（P3级）的单位，严禁从事病毒分离工作。
（4）        实验前要穿戴好防护服装、眼镜、手套，作好技术上的准备。
（5）        由于空气传播狂犬病毒已经得到证实，因此高速混悬或离心操作应在密闭状态下进行。
（6）        实验后要作好善后消毒处理,狂犬病毒对脂溶剂（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），45～70%乙醇，碘制剂和四铵化合物敏感，操作完毕对操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。
2、实验室检测网络组成及职责
（1）        中国疾病预防控制中心牵头，全国各省级疾病预防控制中心及所辖区域内的各级疾病预防控制中心组成实验室检测网络。
（2）        中国疾病预防控制中心职责
A.        诊断试剂的研制、标准化，并推荐质量稳定可靠的诊断试剂；
B.        负责毒株的鉴定和病毒变异性调查；
C.        对各级实验室检测人员进行技术培训。
D.        协助省级疾病预防控制中心完成标本的实验室检测。
（3）        省级疾病预防控制中心职责
A.        收集、保存辖区内各监测点的各种待检测标本。
B.        辖区内各种标本的实验室检测。
C.        对本省监测点标本采集和运送给与技术指导和协助。
（4）        县级监测点疾病预防控制中心职责
采集病例标本，运送病例标本至省级疾病预防控制中心。
3、实验室检测方法
（1）病原检测：
A.        免疫荧光法检测抗原：病人的脑脊髓液或唾液直接涂片、病人的角膜印片或咬伤部位皮肤组织或脑组织印片或冷冻切片，丙酮固定，抗狂犬病毒特异性荧光抗体染色检测狂犬病毒抗原。
B.        快速狂犬病酶联免疫吸附法检测抗原：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬病毒核衣壳IgG包被96孔酶标板，4℃过夜；用含0.3％牛血清白蛋白和5% 蔗糖的pH9.6碳酸盐缓冲液封闭30分钟；将采集到的标本研磨，用pH 7.4 PBS制成30％的悬液，离心取上清加入酶标板孔内，同时设阴性、阳性对照，200 µ l/孔，37℃孵育1小时；洗板四次后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200μl/孔，37℃ l小时后洗板，加入酶反应底物，室温作用30分钟，2M H2SO4终止反应，肉眼观察或酶标仪测定结果。
（2）核酸检测：
RT-PCR方法：以特异性扩增核蛋白（N）基因最保守区域为目的基因，设计一对引物：N1（＋）：5’-587TTT GAG ACT GCT CCT TTT G605-3’; N2（-）：5’-1092CC CAT ATA GCA TCC TAC605-3。唾液、脑脊液、皮肤或脑组织标本以及感染病毒后的细胞培养物或鼠脑均可用于病毒核酸的检测。基本步骤为：待检标本用细胞总RNA分离试剂提取病毒RNA，再通过逆转录反应合成与目的基因RNA序列互补的cDNA，PCR循环特异性扩增目的基因cDNA，电泳检测PCR扩增产物，判断检测结果。
（3）病毒分离：抗原或核酸检测阳性标本可以进行病毒分离以便进行更深入的研究。
A.        细胞培养法分离病毒：将唾液、脑脊液、皮肤或脑组织标本研磨后，用PBS或MEM制成30％悬液→4℃ 2000r/min离心20分钟→取上清接种在96孔或24孔培养板内已形成单层的敏感细胞（鼠神经传代细胞、Vero细胞或BHK21 细胞）上,吸附2小时后补加含2%血清的维持液，37℃ 5％C02 孵育约4～5天，丙酮固定感染后的细胞，用抗狂犬病毒单克隆抗体观察特异性荧光包涵体判断结果。阳性时吸取上清至一无菌容器内-70℃保存备用或继续传代。病毒通过细胞的多次传代可以适应细胞培养并得到扩增。
B.        乳小白鼠接种法分离病毒：30％的病人或动物脑组织悬液，离心取上清，接种1～2日龄乳鼠脑内，每个样品注射一窝乳鼠；注射后的乳鼠应在具有高效滤过装置的负压饲养柜内饲养。症状不典型时可于接种第一代后取脑继续传代，连续传代后潜伏期逐渐规律，一般为5天左右。发病乳鼠若确定为狂犬病毒感染，无菌取脑，-70℃或用含50％甘油的PBS -20℃保存，也可研磨后加灭菌脱脂牛奶制成20％悬液，真空冷冻干燥，长期保存。未发病存活的鼠保留至21天后杀死作免疫荧光检测
(4)抗体检测
A.        特异性抗体检测：在自然感染情况下，狂犬病毒通常由被疯动物咬伤时通过其带有病毒的唾液进入机体伤口内，在入侵部位狂犬病毒基本上不增殖，一般也不侵入血流，故不能形成病毒血症。因此，在感染后的一段时间内狂犬病毒或其抗原不能与机体免疫系统广泛接触，不能有效刺激机体产生抗狂犬病毒感染的免疫应答反应。狂犬病的晚期因血脑屏障作用被破坏，脑内大量病毒抗原得以进入血流，可以刺激机体的免疫系统产生大量特异性抗体。因此，许多狂犬病人在发病早期血清中查不到抗体或抗体滴度很低，狂犬病特异性抗体只在临床疾病的晚期出现。
B.        中和抗体检测：狂犬病疫苗免疫后血清中和抗体水平是测定疫苗免疫力程度的评判指标，WHO狂犬病专家委员会认为中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml血清，表示能得到有效的保护。狂犬病毒中和抗体的检测可以用传统的小鼠中和试验或WHO推荐的快速荧光灶抑制试验（RFFIT）。RFFIT试验时倍比稀释已经灭活的血清样品，同时设阴、阳性血清对照。病毒用标准固定毒CVS株，细胞用BHK21细胞系。首先将稀释的被检及对照血清0.1ml加入96孔细胞培养板中，再在各血清孔中加入0.1 m1标准病毒稀释液（100TCID50），37℃中和1.5小时；然后每孔加入细胞，37℃、5% C02培养过夜后弃掉培养液，PBS洗一次，丙酮固定。干燥后，加荧光素标记的抗狂犬病毒抗体，37℃ 30分钟，PBS洗3次，荧光显微镜观察结果：比较实验组和阴性血清组的荧光灶，实验组中能使荧光灶抑制≥50％的血清最高稀释倍数，即为被检血清的中和抗体滴度。