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发表于 2015-2-1 10:30:31
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五、PCR扩增技术
PCR的全称是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction),它是由Kary Mullis于1987年发明的。1976年人们发现了一种特殊的DNA聚合酶,它可以耐受94℃高温而不失活。1985年Saiki等人发现用聚合酶Klenow大片段催化25次DNA聚合反应(由于此酶不耐高温,所以每次反应需加入新的Klenow片段)可以将原有的DNA量特异地增大数百万倍。将上述两个实验合并在一起,用抗高温的DNA聚合酶(Taq或Vent)代替Klenow片段就形成了目前广泛应用的具有高度敏感性的DNA PCR扩增技术。
根据被扩增DNA片段的序列,人工合成两端各约15～30碱基的单链DNA引物。取极微量的模板DNA,加入Taq或Vent DNA聚合酶,A、C、G、T四种脱氧单核苷酸以及两端的DNA引物,置于PCR扩增仪上即可以进行DNA扩增。一次PCR循环,包括变性→退火→延伸三个过程,通常使用三个可调温度及时间:①DNA变性温度(一般为94℃)及时间,在此温度下模板DNA的双链分开;②退火温度及时间,这个温度可以根据DNA引物的长度和G+C含量计算出来,一般在42℃～62℃之间。退火处理后,DNA引物互补杂交到变性的DNA模板上;③聚合酶延伸反应温度多为72℃,反应时间随被扩增片段的长度而定,一般每合成1 000个碱基需要30～60秒和1单位Taq DNA聚合酶。如合成5kb片段,延伸反应时间应为5分钟,并使用5单位TaqDNA聚合酶(反应体积为100μl)。有时PCR使用双温循环,即92～94℃变性→68℃退火和延伸。理论上,每循环一次,模板DNA量扩大一倍,所以模板DNA的量是按2n指数幂进行扩增的,n代表PCR次数。如模板DNA数为1,PCR循环25次后,模板数将增至225,即33554432, 但在实际操作中,扩增效率往往低于理论值。这是因为DNA引物经多次循环后被消耗,在下一次循环时,没有足够浓度的引物与模板退火杂交。此外,多次高温处理后,Taq DNA聚合酶活性也会下降。即使这样,PCR也可在数小时之内对仅有的几个拷贝的基因放大数百万倍,使其在凝胶电泳后形成明显可见的DNA带。这是PCR技术正逐步用于临床病毒检测的最重要原因。
另一方面,很高的合成效率使得PCR容易出现非特异性扩增,所以要获得预想的结果,必须选好欲扩增片段在基因组上的位置,设计特异的引物序列,优化PCR反应的各种条件和选定适当的循环参数。
(一)诊断PCR技术的设计策略
1.扩增片段的确定
为了获得特异的扩增,仅仅知道被检病毒的基因序列是不够的,必须选择病毒基因组上具有独特结构的基因区域进行PCR扩增,这一区域在序列组成或长度上,无论与较近亲缘关系还是较远亲缘关系的其他病毒应有明显的区别。
2.引物设计
引物是影响PCR扩增效率和特异性的关键因素。作为诊断PCR,选择引物应遵循一些基本原则:①引物长度以15～30nt为宜;②正义、反义二条引物链间的距离适中,一般使扩增出的片段在300～1 000bp之间,如果用反转录-PCR检测RNA病毒,引物间距离控制在500bp左右最佳。片段过短则影响电泳结果判定,过长则不易扩增;③引物碱基组成应随机分布,G+C含量在45%～55%左右为宜;④引物自身不形成二级结构,引物间不应有互补序列(4个碱基以上);⑤引物序列必须是被检病毒特异的;⑥原则上引物3’末端碱基与模板DNA一定要配对,此外3’末端碱基最好选T、C或G, 而不选A。
3.PCR缓冲液
PCR反应标准缓冲液应含:50 mmol/L KCl, 10mmol/L Tris•HCl(pH8.3),1-5mmol/L MgCl2和100μg/ml明胶或乙酰化牛血清白蛋白(BSA)。其中Mg2+浓度变化明显影响反应的特异性和扩增效率。Mg2+过多则导致非特异扩增产物增加;Mg2+不足则扩增效率降低。为了取得最佳扩增效果,可先行预实验,以确定最佳Mg2+浓度。
4.引物量
PCR反应中所用引物浓度通常在0.1～0.5 μmol/L之间。浓度过高将出现非特异片段的扩增,过低则不能扩增出足够的特异带,最佳用量可以通过系列浓度实验来确定。
5.dNTP
dNTP(dATP,dTTP,dCTP和dGTP)溶液的pH值应调至7.0。在标准PCR反应中,每一种dNTP的使用浓度为50～200 μmol/L(足够产生7～25μg DNA),更高浓度dNTP将导致错误掺入,从而影响扩增序列的真实性。
6.Taq DNA聚合酶
PCR反应中,该酶的用量,通常是2-5单位。加酶量过多将导致非特异性片段的扩增。
7.变性剂
反应中加入适量变性剂(如二甲亚砜、尿素、甲酰胺等)可减少模板的二级结构,提高反应的特异性。我们在用PCR扩增猪瘟病毒cDNA片段的反应中,加入5%甲酰胺,不但提高了反应的特异性,而且目的cDNA片段的产量大大提高。
8.循环参数
用3种不同温度处理样品,使之变性,退火和延伸,就可进行PCR循环。
变性是循环的第一步,变性不完全,扩增明显受到影响,变性温度太高或时间太长, Taq DNA酶的寿命受到影响,使得循环次数明显减少。绝大多数PCR变性温度在92～94℃之间,时间通常控制在40秒左右。
退火是循环的第二步,退火温度的选择决定着引物与模板互补结合的效率和特异性,是PCR能否成功的关键因素。选择适当的退火温度,取决于引物的长度、G+C含量、模板的纯度和丰度。较高的退火温度可提高引物与模板配对的特异性,从而提高反应的特异性。就含量和纯度较高的模板而论,对于G+C含量在50%左右的约20nt长的引物,55℃是常用的退火温度。如果引物较短(12～15nt)退火温度可降至40～45℃。对于丰度极低的模板的PCR,特别是稀有RNA模板的反转录PCR(RT-PCR),在最初的1～5个循环可以用更低的退火温度,然后再行正常的退火温度,这样能明显提高PCR的成功率。我们在猪瘟病毒和犬瘟热病毒基因组RTPCR扩增中,第一次循环的退火温度用37℃,从第二次循环开始改为50℃退火,成功地扩增出了常规退火温度下没能扩增出的特异cDNA片段。无论什么样的退火温度,时间通常控制在50秒左右。
循环的最后一步是延伸,由于Taq DNA聚合酶只有在高温下才能发挥最大活性,所以延伸在70～75℃温度下(通常在72℃)进行,但延伸反应的时间随欲扩增片段长度的增加而适当延长。一般来说,每扩增1kb的片段,用1分钟时间是足够的。温度及时间确定以后,PCR循环次数主要取决于模板量。但循环次数通常选定在25～30次,经过这些次数循环后,PCR产物的累积即可达到电泳后肉眼可见程度。除非模板浓度极低,如只含一个拷贝,循环可增加至40次。
目前双温PCR正逐渐被采用,其特点是退火与延伸在一个温度下进行,这一温度通常在68℃左右。双温PCR大大简化了操作程序，缩短了操作时间，同时明显提高了反应的特异性。
(二) PCR用于DNA病毒的检测
无论单链或双链病毒DNA，均可用PCR进行检测。检测样品可以是纯化DNA,也可以是细胞、组织及任何可能含有病毒的样品。一般无需提取DNA,可直接取少量样品(少于10μl),煮沸变性10分钟后进行PCR测定。如前所述,PCR检测需要两个特异的DNA引物,引物之间的距离(决定扩增DNA片段的长度)控制在0.3～1kb之间最佳。如果扩增片段达2～5kb,PCR反应产物在随后的电泳中,可能出现多条DNA带,这时往往需要用Southern 转移杂交来鉴定哪一条是病毒特异的带。为了尽量减少PCR的非特异反应,可进行如下调整。
1.增加DNA引物的长度。一般引物长15～20碱基,但可以增加到25～30碱基;
2.引物加长后,提高退火温度,增加反应的特异性;
3.选择其它DNA序列重新合成特异的DNA引物;
4.如果病毒的序列来源于cDNA,则应考虑到某些病毒DNA上含有内含子,可能使被扩增的片段远远大于原设计,甚至无法得到这样大的片段。
(三)PCR用于RNA病毒的检测
由于Taq或Vent DNA聚合酶不能以RNA为模板合成cDNA,所以不能对RNA病毒核酸进行直接PCR。首先必需提取病毒RNA,加入反转录酶合成cDNA,然后才能进行PCR扩增—反转录-PCR(RT-PCR)。RT-PCR必需进行两步反应(反转录酶不耐热)。病毒RNA可以从各种适合的组织器官、排泄物、分泌物或细胞培养物中提取,这取决于被检病毒的种类。RT-PCR同样具有很高的敏感性。作者从100μl猪瘟兔化弱毒的犊牛睾丸细胞培养物中提取了病毒RNA,用下述RTPCR方法,从中扩增出了特异cDNA片段。
(四)PCR用于分子流行病学研究
病毒在自然界中产生自发突变株是长期困扰病毒学工作者的棘手问题。例如流感病毒、牛病毒性腹泻病毒、脊髓灰质炎病毒、口蹄疫病毒等都会因地理或生态环境，动物体的内环境(如易感性、免疫压力等)，气侯和时间因素等的变化而自发产生基因突变的变异株,使人或动物的免疫系统无法正确识别,导致原有的疫苗接种失败,造成病毒大量传播。
就其本质来说,病毒发生突变是指病毒基因的缺失、插入、交换和基因点突变等。PCR技术的出现,使人们有可能大规模、且十分精细地研究病毒突变的规律及突变位点,迅速地鉴定突变株,从分子水平上阐述病毒病的流行规律,这是目前分子流行病学的主要研究内容之一。
在可能发生缺失的病毒基因两侧合成DNA引物,进行PCR或RT-PCR,通过电泳即可清楚地看到被扩增的片段小于对照株;如果外源基因插入某个位点,用这个位点两侧的DNA引物进行PCR扩增,就可以发现扩增的片段大于对照株。
美国科学家用多种因素(化学、物理)处理脊髓灰质炎病毒,然后制备cDNA。对混合的cDNA进行PCR,发现了多种不同的突变株。他们还使用PCR研究不同口蹄疫毒株之间的重组。他们首先在两个毒株的核酸序列上寻找两个非同源序列,合成DNA引物。引物Ⅰ只能与A株杂交,引物Ⅱ只能与B株杂交。因此,用这两个引物不能对A株或B株的cDNA进行扩增。将A、B两株在不同条件下混合感染单层培养细胞,提取病毒RNA制备cDNA,最后用引物Ⅰ和Ⅱ进行PCR。如果电泳中发现特异的DNA带,同时此DNA带能与32P标记的两个DNA引物杂交,则说明A、B两株的基因组RNA在两个DNA 引物中间的序列发生了基因重组。用此方法可以迅速准确地测定试验室内病毒发生基因重组的条件。令人惊奇的是经PCR扩增后,电泳中往往出现多条分子量不同的带,核酸序列分析说明A、B两株间有多个不同的重组位点。有人采用RT-PCR技术,对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的基因突变进行了研究,发现许多致细胞病变BVDV毒株的P80基因区有外源核酸序列的插入(大小约数百个碱基),而非致细胞病变毒株则没有这种插入。
当然,PCR结果还难以说明病毒遗传变异株的稳定性、毒性、滴度、致病性等多项病毒学指标,然而这些研究结果说明了病毒间基因重组的复杂性和重组的条件,使人们有可能着手研究病毒重组突变机理。
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发表于 2015-2-1 10:28:17
NA病毒可在限制性内切酶切割后直接进行克隆；RNA病毒则必须先在试管内反转录成cDNA后再行克隆；反转录病毒可从感染细胞中提取前病毒DNA，随后再行克隆。总的来说，病毒基因的克隆包括以下几种类型：
