设为首页收藏本站

中国病毒学论坛|我们一直在坚持!

 找回密码
 立即注册

QQ登录

只需一步,快速开始

搜索
热搜: 活动 交友 discuz
查看: 1994|回复: 0

[细菌真菌] 双链 DNA 酶预处理可降低分子诊断真菌感染中试剂污染

[复制链接]

2204

帖子

2852

学分

3万

金币

管理员

Rank: 9Rank: 9Rank: 9Rank: 9

积分
2852
发表于 2016-5-4 10:44:07 | 显示全部楼层 |阅读模式
核酸扩增技术有别于传统的真菌诊断方法,即便是极微量的真菌 DNA,也能够检测出。它具有灵敏度高,能够快速筛查出怀疑侵袭性真菌感染患者的优点。
然而,PCR 扩增技术的致命缺点也源于它的高敏感性,有时极低水平的污染也有可能导致假阳性结果。尤其是某些宽泛的检查真菌感染方法,例如基于 16S rRNA 基因检测时,如果 PCR 试剂如 Taq DNA 聚合酶或是尿嘧啶 -N- 糖基化酶(UNG 酶)被真菌污染,那么检测效果将大打折扣。
有文献报道称,空气中的分生孢子、PCR 扩增所用的引物、探针、酶以及 DNA 提取试剂盒中微量的真菌 DNA 是污染的主要来源。
为了解决这个问题,来自奥地利儿童癌症研究所的 Lion 团队建立了一种基于双链特异性 DNA 酶去除真菌污染的方法。由于酶的双链特异性,单链 DNA 分子如引物、Taqman 探针都不会被酶所消化,除非它们自身形成了发夹结构或引物二聚体。该研究结果发表在近期的 Journal of clinical microbiology 杂志上。
1. 在进行正式的诊断性实验前,先用双链 DNA 酶预处理 PCR 反应中的各种试剂。
2. 每一种探针和引物配制成一定浓度的溶液后,先在 40℃ 预热 5 分钟,以便去除探针自身形成的发夹结构或引物二聚体。
3. 然后 40℃ 30 分钟,进行酶消化反应,之后再 65℃ 15 分钟灭活 DNA 酶。
4. Master Mix 溶液酶消化的反应条件稍有不同,先 37℃ 20 分钟进行消化,之后 60℃ 20 分钟将酶灭活。
研究人员发现,不论是引物、探针还是 Master Mix 溶液,均存在一定程度的真菌 DNA 污染,经酶处理过的试剂,诊断性实验中 PCR 反应的 Ct 值明显高于未处理组,DNA 产物浓度低于未处理组数百倍。通过使用这种双链特异性的 DNA 酶,大大降低了由试剂污染带来的假阳性结果的机率。
鉴于目前还没有商品化的真菌级别的试剂盒,研究人员强烈建议用这种方法常规监测 PCR 检测试剂是否存在真菌污染,预处理试剂消除可能存在的真菌 DNA, 对减少因试剂污染导致的真菌感染假阳性结果至关重要。
如果有商品化的试剂盒存在,可以将 DNA 酶直接加入到 PCR 反应中,缩短检测时间,那将是皆大欢喜的结果。一方面,简化了操作流程,减少了检测人员的操作步骤,可以更快出结果。另一方面也减少了患者和医生的等待时间。

来源:丁香园作者:汐芮

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

QQ|论坛App下载|Archiver|小黑屋|中国病毒学论坛    

GMT+8, 2024-3-29 19:11 , Processed in 0.090426 second(s), 29 queries .

Powered by Discuz! X3.2

© 2001-2013 Comsenz Inc.

快速回复 返回顶部 返回列表