单抗的制备（系列连载篇）

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本帖转自：http://biosky.haotui.com/viewthread.php?tid=281   作者：xiaobin

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本人有单抗的制备技术的完整过程，现在作为系列连载贡献出来，希望和有兴趣的同志在此共享：

一、前言
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! O7 V7 L6 ]8 I( _; q1975 年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

/ S. e7 O3 N" k4 [( N9 c制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤。
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虽然单抗技术已经非常成熟，但是由于其经济价值，仍然有很多人在从事这项研究，而且其中也会遇到很多这样那样大问题
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2 U! D8 P8 Q% R$ `[ 本帖最后由 xiaobin 于 2007-8-27 08:26 编辑 ]
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二、动物的免疫

  c" ]$ v/ E" l: W& G1 E; A选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

$ a( r; ^: n, J/ m$ \　　1.　颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:
) A# x1 B+ N5 ~6 A2 @/ S1 C4 C8 B　　　　　　　　　　初次免疫　　　　　　　1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射)
7 [9 w0 Q0 H0 N　　　　　　　　　　　　↓　2～3周后
3 x( h: E, z" \8 h. R　　　　　　　　　　第二次免疫　　　　　　1×10７／0.5ml ip
　　　　　　　　　　　　↓　3周后
& q& f" s( x! O, y. S8 ~+ ~　　　　　　　　　　加强免疫(融合前三天)　1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)
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5 W7 U, C2 i0 Q　　　　　　　　　　取脾融合
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; Y2 v# [- J8 N! Y, V　　2.　可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
　　　　　　初次免疫　 Ag　1～50μg　加福氏完全佐剂皮下多点注射
7 _7 D9 G5 N9 _7 z3 I　　　　　　　　│　　　　　(一般0.8～1ml　0.2ml／点)
0 k  L0 Y% R/ U. L) V　　　　　　　　↓3周后
　　　　　　第二次免疫　剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip
　　　　　　　　│　　　　　　　(ip剂量不宜超过0.5ml)
　　　　　　　　↓3周后
　　　　　　　第三次免疫　剂量同上，不加佐剂，ip
; K  N  g# I. O$ P& W, l2 S/ T　　　　　　　　│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)
, `) X7 e3 G/ r$ e- c0 z' {　　　　　　　　↓2～3周后
　　　　　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv
　　　　　　　　↓3天后
　　　　　　　取脾融合

3 {' V+ r  |* r( C& j1 n& I6 V　　目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

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三、骨髓瘤细胞的选取

. o: q+ h' ~' v  u+ C# P& K9 b" Q; [骨髓瘤细胞能产生并分泌大量的免疫球蛋白，这样的瘤细胞融合后，可能影响或降低所分泌抗体的滴度，所以必须选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞。

! |1 Z9 w% D' k2 J6 {. v选择骨髓瘤细胞的条件：①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml；④生长速度快，繁殖时间短。

' M/ {, t8 X8 K. H+ ^6 H" l目前常用的Balb/c小鼠产生的骨髓瘤细胞株有：①S194/5XXO•BU•1；②SP2／0—Ag14（简称SP2，常用）；③P2—X？ ¬—Ag8•6•5•3（简称653）；④FO以653最为常用，它是由矿物油4－甲基－15烷（Pristane，降植烷）诱发出来的一种浆细胞瘤（Minerol Oil plasmacy toma，MOPC）并经过培育形成一株8-氮鸟嘌呤有抵抗力的亚系。
, G, m; [( Z& f' Q; v6 V
) S$ a1 p. G8 }: h骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195℃液氮罐中，试验时复苏、增殖、传代即可。
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由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态，很容易脱落，因此不需要胰酶处理。很多书上说为了防止出现返祖现象，在融合前，可将培养基内加入15μg/ml 8－氮鸟嘌呤，我个人认为没有这个必要，因为加入8-AG之后，骨髓瘤细胞一般状态都不会很好，这样一来对于融合的影响更大。

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四、关于饲养细胞

在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。在细胞融合和单克隆的选择过程中，就是在少量的或单个细胞的基础上使其生长繁殖成群体，因此在这一过程中必须使用饲养细胞。许多种类的动物细胞都可以做饲养细胞，如正常的脾细胞、胸腺细胞、腹腔渗出细胞等，常选用腹腔渗出细胞，其中主要是巨噬细胞和淋巴细胞。应用腹腔渗出细胞的好处是：一方面做饲养细胞，另一方面巨噬细胞可以吞噬死亡的细胞和细胞碎片，为融合细胞的生长造成良好的环境。腹腔细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系鼠。也可以是其他种类的小鼠，如C57鼠，昆明小白鼠等。

+ y6 ^. f  i' t2 R( |2 \1．材料
（1）小鼠（Balb/c或C57小白鼠）若干只。
（2）11.6％蔗糖溶液（经10磅30min高压灭菌）。
; @2 m- p% ^) J. E/ ?
2．操作方法
4 b1 l, K3 ~$ T/ [（1）拉颈处死小鼠。
, g/ N1 @" A! w4 W; m, b' F（2）70％酒精浸泡消毒10min。
$ \& A6 D  u+ s6 u$ }. v1 \（3）用手术剪将小鼠腹部剪开一小口，剥开皮肤，露出腹腔。
（4）用注射器将4ml 11.6％蔗糖溶液注入腹腔，用手指轻揉1min仍用该注射器回抽腹腔液体，加入离心管。
1 r: S6 {0 N( X- `& R* `8 w（5）1 000r／min离心10min。
（6）取上清，以HAT选择培养液将细胞制成悬液。台盼蓝染色计数活细胞，使每毫升含40万个活细胞。
( M3 O: N  J- _) n$ E, z- c（7）以1ml吸管将细胞种入微量培养皿，每孔0.05ml，含2万个细胞，放入CO2培养箱培养，即可供细胞融合和克隆化之用。如果在融合后发现在培养孔中饲养细胞数量少，则可以在细胞换液时再加入一些。

个人认为取饲养细胞时切忌贪心，别总是想多取一些，因为这样有可能造成一些不必要的麻烦，我又一次取饲养细胞时就曾经将不知是什么血管刺破，导致所取的饲养细胞里面出现大量的红细胞。有人说饲养细胞可以不用，我觉得还是用一点比较好，但是一定不要太多，占到30%就足够了，太多了很影响细胞的观察，而且会导致骨髓瘤等细胞不能很好的贴壁。

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五、取脾脏

融合用的免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
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取脾脏也是一个比较重要的环节，可以说如果出现污染有很大一部分原因是由于融合过程引起的，还有一部分原因就是由于取脾脏这个环节引起的。

取脾脏的要点就是一定要尽量无菌操作，根据实际情况来看，完全无菌是不可能的，但是取脾脏的时候一定要尽量减少操作的时间，主要是研磨这一环节。在研磨之前取脾脏之后，首先要将脾脏上面包被的膜剪掉，这样会节省很多研磨的时间。

) G9 x; |5 j2 s脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。

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六、融合与筛选
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3 S, e" s. ~4 u' P/ d最重要的一步是融合，我想这也是单抗制备过程中最难的一步了。

　(一)　细胞融合流程
　　1　取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。
  p5 O) x! z( G% G! X  u+ t4 x　　2　同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。
1 H3 c% J# A3 H/ `　　3　将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。
　　4　弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
　　5　轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
! \& A( j7 m$ P　　6　在室温下融合:
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①30秒内加入预热的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌。
$ I, W; b' S+ D　　②　作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。
　　③　加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。
　　7　离心，800rpm，6分钟。
7 u+ q+ h+ x/ P0 @" U　　8　弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。
6 [) S% a* U4 t" {( {" `　　9　根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。
　　10 将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养。
# V! J' M0 w3 _( Z4 f; X3 x　　一般一块96孔板含有1×107脾细胞。
　
　(二)　HAT选择杂交瘤
　　应用HAT 选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。
　　一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。
　　因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果。
　　50×HAT
　　H:　5×10-3M
3 N8 b% B5 S/ z2 |' N' T* I　　A:　2×10-5M
　　T:　8×10-4M
4 M7 o  }2 Q. O* N1 o+ v　　一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。

融合的关键除了无菌操作之外就是动作一定要轻柔，就像制备感受态细胞一样，而且一定要混匀，不然在镜下会出现成团的细胞，这是很影响本就不高的融合率的。

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七、抗体的鉴定
　
筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
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4 G+ j* o2 ]! {, f0 V; s! [　检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
　　常用的方法有:
7 I9 V  p, N0 U5 ^1 ~　　1.　ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。
+ `# F( w. }+ O7 s　　2.　RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。
( d+ J) ^+ W5 @0 M　　3.　FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。
- {* R7 o* |8 p$ M　　4.　IFA用于细胞和病毒McAb的检测。

可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。

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八、性质检测

对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定:
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( P0 T" p5 d) a5 X8 s; }& `% _　1. 　抗体特异性的鉴定：除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。② 　制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。
　
　2.　McAb 的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或 IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PEG(3％)，将有利于沉淀线的形成。
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　3.　McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。
　
　4.　McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。
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　5.　McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。

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九、后续工作
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克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

　　(一)　克隆化方案
) b' Q1 ~% ^0 |　　用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。
　　1.　有限稀释法的程序
+ ?5 j) A9 d0 N　　①　制备饲养细胞悬液(同融合前准备)
　　②　阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml
　　③　取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml 含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。
5 p! f1 N2 P) D5 R　　④　培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。
　　⑤　第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。
( w1 F2 _# f) C- w# y4 g, [　　注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。
　　2.　软琼脂法
　　①　软琼脂的配制
　　含20％FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640
: e( e3 J6 |) v& k　　1％琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。
　　0.5％琼脂：由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。
, Z) \! v5 I" a5 [. ]6 j7 b4 Q　　②　用上述0.5％琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。
3 u! a0 X2 c' B% }　　③　按100／ml，500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。
　　④　1ml 0.5％琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。
; ~/ j) X, N: a  ]( A　　⑤　混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。
. |9 j* @. `5 g( ~& I  Q/ r$ c1 Z' n　　⑥　4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。
　　⑦　检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。
　
　　(二)　杂交瘤细胞的冻存
　
* \- V* V8 o/ _; r/ A　及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。
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8 Q$ X! L" f$ B, ]1 M- V* r　杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每个冻存管中含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一管。
$ E! B; U3 W/ R0 Z3 c　　细胞冻存液:
2 M" N4 n0 I9 b$ d2 T/ `+ }　　50％小牛血清
　　40％不完全培养液
　　10％　DMSO(二甲亚砜)
2 O3 }+ M; b* X　　冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃ 后放-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。