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标题: 认识杆状病毒连载之一：杆状病毒概述 [打印本页]

作者: virology 时间: 2015-7-8 10:26
标题: 认识杆状病毒连载之一：杆状病毒概述
原贴由stare024发表于 2011-1-10 13:26
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      杆状病毒(Baculovirus)是一种有囊膜的双链DNA病毒，基因组大小为80- 178kb，因外形成杆状而得名，目前已发现有600多种。杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群，也是研究最多，最深入的，实用意义最大的昆虫病毒[1]。20世纪80年代建立的杆状病毒表达载体系统(Baculovirus Expression Vector System，BEVS)已被公认为当代四大真核表达系统之一[2,3]，其特点是可以容纳较大片断的外源基因插入，而超高效表达能力、安全性、易操作性更是引人注意，目前，该系统在昆虫生理生化研究、药物研究、生产亚单位疫苗抗原、表达有酶学活性的糖蛋白、基因治疗载体等方面有着很广阔的应用前景。
      同时，杆状病毒作为昆虫的天然病原，又在新兴生物农药杀虫剂方面表现出很强的优势，被称为害虫的无形杀手[4]。其最大的特点是残留低，专一性强，杀灭和控制害虫效果好，害虫不易产生抗性，特别是对人畜、天敌和环境安全，使其成为生产绿色食品，保护生态环境稳定不可缺少的生物农药，尤其适合于林业害虫的控制，经过分子生物学改造的杆状病毒也适用于无公害蔬菜，棉花、玉米等粮食作物和经济作物的害虫防治。
      1.1 杆状病毒分类
      杆状病毒是一类感染节肢动物的病毒，以往将杆状病毒科(Baculoviridae)分为三个属，核型多角体病毒属(Nucleopolyhedrovirus，NPV)，颗粒体病毒属(Granulovirus, GV)，非包埋杆状病毒属(Nonoccluded baculoviruses)。根据1995年国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第六次报告，将非包埋杆状病毒属剔出杆状病毒科，分为核型多角体病毒属和颗粒体病毒属[5]，其中核型多角体病毒属病毒根据囊膜内核衣壳数目的多少分为单粒包埋型多角体病毒(SNPV)和多粒包埋型多角体病毒(MNPV)。
      最近有学者建议按照宿主不同，将杆状病毒分为4个属[6]：alphabaculoviruses (Lepidopteran-specific NPV)，betabaculoviruses(lepidopteran-specific GV)，gamma- baculoviruses (hymenopteran-specificNPV)，and deltabaculoviruses (dipteran-specific baculovirus)。这种宿主相关联的病毒分类最初是在灵长类小DNA病毒[7](乳头状瘤病毒和多瘤病毒，papilloma and polyoma viruses)中发现的。病毒宿主在遗传上分离并形成新的物种，而病毒也随着宿主的进化而进化，我们称为宿主依赖性进化。随着杆状病毒的基因组数据的增多，宿主依赖性进化变得越来越可信了。鳞翅目NPV又可以分为两个主要的群[8]，GROUPI和GROUP Ⅱ，二者的主要区别在于GROUPI以gp64作为其出芽病毒的功能蛋白与细胞膜融合[9]，而GROUP Ⅱ取而代之的是F蛋白，另外有研究表明，除gp64外，还有Ac1 (ptp)，Ac16 (BV-ODV26), Ac27 (iap-1)，Ac30，Ac42 (gta)，Ac72，Ac73，Ac114，Ac124，Ac132，Ac151(ie-2)等11个基因仅在GROUPI中出现[10]，在GROUPⅡ中没有相应的同源基因，可见，这两个亚群的分化，除了gp 64和F蛋白外，还有着更复杂的机制。
      1.2 杆状病毒发育循环
      杆状病毒发育循环的特征是包含两个独特的时期[1]。在第一个时期，即接种病毒到24h，病毒核衣壳在细胞核内病毒发生基质上装配，然后通过细胞质出芽的方式，获得囊膜，这种病毒称为细胞释放性病毒(cell released virus，CRV)，又称为出芽型病毒(Budded virus，BV)，这种病毒主要是在同一宿主体内的不同组织和细胞之间相互感染；当细胞内出现包涵体时，第二个时期变的很清楚，并将一直持续到细胞解体为止。在这一时期，CRV的释放数量急剧减少，细胞核内的病毒被封入核内新装配的囊膜内，并包埋进多角体蛋白的结晶基质逐渐形成多角体，这一类型病毒是昆虫死亡后，释放到外部环境中，通过一定的途径在不同的昆虫个体间传染的作用。多角体内的病毒粒子称为多角体衍生病毒粒子(polyhedron derived virus，PDV)或包埋型病毒(occluded virus，OV)。当昆虫死亡后，多角体释放进入周围环境，由于多角体很稳定，能在环境中长期存在并保护PDV的活性，而一旦被宿主食入，在宿主中肠高pH消化液(10)作用下，多角体很快溶解，释放出的PDV，借囊膜与中肠上皮细胞绒毛膜的融合作用而脱去囊膜，进入细胞，形成有效感染。
      2 杆状病毒表达载体系统
      昆虫杆状病毒研究较多的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosisvirus, AcMNPV)，其宿主是草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda, Sf)；家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV)，其宿主是家蚕(Bombyx mori)，用来表达外源蛋白也多用这两种杆状病毒载体[2,3]。
      杆状病毒的基因表达分为立早期表达、早期表达、晚期表达、极晚期表达4 个阶段。其中在极晚期基因表达过程中有两种高效表达的蛋白：多角体蛋白和P10 蛋白，两个基因的启动子均具有很强的启动性。多角体蛋白基因polh是一个表达量极高的极晚期基因，感染后期在细胞中的累积可高达30%～50%，从基因组中删除polh基因时，其子代病毒不能形成多角体，但并不影响病毒体的复制，因此，polh基因位点是杆状病毒表达系统的理想外源基因插入位点[2]。P10也是一个高效表达的极晚期基因，同时又是病毒复制非必需基因，因此P10位点也常被用作外源基因插入位点。
      杆状病毒表达载体系统的优越性
      杆状病毒表达系统具有以下的优越性[11,12,13]：(1) 安全性高：杆状病毒的宿主仅限于无脊椎动物，而对人畜和其他脊椎动物没有感染性，特异性强，相对于腺病毒载体(Adenovirus vector)和慢病毒载体(Lentivector)来说，安全性好。(2) 表达效率高：应用杆状病毒极晚期多角体蛋白启动子和P10蛋白启动子强效表达外源蛋白，表达量最高可达所感染细胞总蛋白量的50%，而且多角体蛋白和P10蛋白是病毒基因组内的非必需片段，插入外源基因后不影响病毒的复制和感染。(3) 表达的蛋白具有生物学活性：相对于原核表达系统来说，昆虫细胞为真核生物细胞，其对蛋白质表达后修饰加工的方式与哺乳动物细胞接近，能识别并正确地进行信号肽的切除及磷酸化、糖基化等反应，并且使外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物的形成，使其在结构及功能上接近天然蛋白。(4) 外源基因在插入到多角体蛋白基因座位时，必然引起后者的缺失或灭活，因此，重组病毒将不能产生多角体，这不仅为重组病毒提供了供选标记，而且重组病毒不能像野生病毒一样在环境中存在，更加安全。(5) 容量大：杆状病毒基因组大约130Kb，具有多个天然强启动子，也易于构建新的人工启动子，可同时表达多个基因，并且可容纳大片段外源基因。(6) 基于BmNPV所构建的重组病毒具有更狭窄的宿主范围，除了家蚕外，基本没有其他宿主，而且家蚕没有飞行能力，完全靠人类饲养，而且关于家蚕的研究已持续多年，遗传背景相对清楚，大规模饲养技术成熟，成本大大降低。正是由于该表达系统具有的优点，目前已有病毒、细菌、真菌、动植物等多种生物的基因在昆虫细胞或幼虫体内获得高表达。

参考资料：
      [1] 吕鸿声昆虫病毒分子生物学[M], 北京: 中国农业科技出版社, 1998: 149-153.
      [2] Smith G E, Summers M D, Fraser M J, Production of human beta interferon in insect cells infected with a Baculovirus expression vector [J], Molecular and Cellular Biology, 1983, 2156-2165.
      [3] Maeda S, Kawai T, Obinata M, et al Production of human α-interferon in silkworm using a baculovirus vector [J], Nature, 1985, 315: 392-394.
      [4] 秦启联, 害虫的无形杀手-核型多角体病毒 [J], 生物学通报, 2003, 38(7): 25.
      [5] Volkman LE, Blissard GW, Friesen P, et al Baculoviridae: Taxonomic structure and properties of the family，In Classification and nomenclature of viruses: Sixth Report of the International Committee for the Taxonomy of Viruses [J], Archives of Virology, 1995, 10: 104–113.
      [6] Jehle JA, Blissard G.W, Bonning BC, et al，On the classification and nomenclature of baculoviruses: a proposal for revision [J], Archives of Virology, 2006, 151: 1257–1266.
      [7] Soeda E, Host-dependent evolution of three papova viruses [J], Nature, 1980, 285: 165-167.
      [8] Zanotto PM, Kessing BD, Maruniak JE, Phylogenetic inter-relationships among baculoviruses: evolutionary rates and host associations [J], Journal of Invertebrate Pathology, 1993, 62: 147–164.
      [9] Pearson MN, Rohrmann GF, Transfer,incorporation and substitution of  envelope fusion proteins among members of the Baculoviridae、Orthomyxoviridae and Metaviridae(insect retrovirus) families [J], Journal of Virology, 2002, 76: 5301- 5304.
      [10] Herniou EA, Use of whole genome sequence data to infer baculovirus phylogeny [J], Journal of Virology, 2001, 75: 8117-26.
      [11] Ailor E, Takahashi N, Tsukamoto Y. N-glycan patterns of human transferring produced in Trichoplusia ni insect cells: Effect of mammalian galactosyltranferase [J], Glycobiology, 2000, 10: 837-847.
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      [13] Jarvis DL, Developing baculovirus-insect cell expression systems for humanized recombinant glycoprotein production [J], Virology, 2003, 310:1-7.

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