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标题: [转移贴]求助。bac10转座的问题 [打印本页]

作者: virology 时间: 2015-7-7 15:31
标题: [转移贴]求助。bac10转座的问题
原贴由aqua08 发表于 2010-5-4 19:35
http://biosky.haotui.com/thread-14758-1-6.html

我bac10转化DUAL阳性质粒后，蓝白斑筛选M13引物检测，目的条带都是2000左右，达不到所需的长度，PCR反映条件是准确的，用的菌p检测，而且长度不同的基因转座完检测都是一样的2000多，各位知道是啥原因吗

以下为会员回复:

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stare024 于 2010-5-4 22:41 回复:
如果用DUAL载体转化的话，重组病毒用M13引物PCR，所得到的条带大小应该是
目的基因的长度+DUAL载体上的2500+bp左右。
因为DUAL载体在多克隆位点之外，在转座位点之间还有2500+bp左右，包括有多角体启动子，P10启动子，Gen抗性基因，以及PolyA片段等，
根据你描述的情况，应该是转座没有成功，
建议重新转化，或者重新PCR，延长PCR的时间。

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158584843 发表于 2010-5-5 07:28 : 正常的阳性是2400+目的片段，你只有2000多，肯定不是阳性。前面的一步你连接的正确吗，鉴定了吗？我蓝白斑的时候挑过阴性菌，阴性的PCR片段是250左右。我感觉你前一步没连上，你再确认下。或者PCR时候你的延伸时间不够吧？再做做，我蓝白斑筛了3次才成功！

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