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标题: [转移贴]如何获得能高效感染家蚕的重组杆状病毒？ [打印本页]

作者: virology 时间: 2015-7-7 08:53
标题: [转移贴]如何获得能高效感染家蚕的重组杆状病毒？
原贴由wangyongmei 发表于 2010-8-3 21:27
http://biosky.haotui.com/thread-15886-1-7.html?jdfwkey=ni0d61

我们实验室目前所用的系统是Bac-to-Bac系统，想通过构建重组BmNPV来感染家蚕生产重组蛋白，但是转染家蚕细胞后的重组病毒注射家蚕后没有任何效果，推测可能是由于病毒滴度过低造成的。请问有哪位达人支支招你们是如何获得能高效感染家蚕的重组杆状病毒的?谢谢！

以下是战友的回复
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stare024 发表于 2010-8-3 23:19 ：收获重组病毒后，可以在BmN细胞上多扩增一些，
bac-to-bac DNA转染细胞后获得的第一代病毒可以连续在细胞上扩增2-4次，
一般得到的病毒滴度可以达到10的9次方PFU。
然后注射4龄或者5龄起蚕。每头10ul左右，一般4-5天左右可有发病症状。
注射前后1天应该给蚕添喂抗生素，防止发生细菌性疾病。
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wangyongmei 发表于 2010-8-4 20:46 ：你好！谢谢你的回复！我把病毒在家蚕细胞上扩增2代后进行超离浓缩后再感染了好几代细胞，可还是没有表达，我也是近来才开始用家蚕细胞表达，可好像在生产病毒方面总是失败，很有挫败感。我想请问下超离的话对病毒会破坏吗？另外我想请问一下在注射前后一天喂抗生素，我们没有这样做，请问你们用的是氯霉素吗？浓度是多少？
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stare024 发表于 2010-8-5 10:29 ：to 3# wangyongmei

首先问你，感染重组病毒后，蚕和细胞有没有发生病理变化？

其次，个人认为，得到的病毒没有必要超速离心。
如果你一直检测不到表达，是否考虑转座载体pFast-Bac 构建是否正确？
产生的重组病毒是否正确？

另外，你转化的bacmid 是AcBacmid，还是BmBacmid，
即便是得到的重组病毒不正确，如果是BmBacmid的蚕和细胞也应该有病理变化的，

至于抗生素嘛，我曾经用过氯霉素，后来改用氟苯尼考。
浓度一般是一个胶囊的粉末溶解在500ml水中，
然后涂在桑叶上，晾干既可
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wangyongmei 发表于 2010-8-5 19:30 ：感染重组病毒后细胞没有什么病理变化，但似乎家蚕细胞在病毒滴度较低的病毒感染后变化是比较不明显的。家蚕注射病毒后也没有明显的病变，注射后6天左右收蚕，有些都已经结茧了，没有结茧的收了之后检测并没有目的蛋白的表达。
病毒滴度太低所以才考虑超离浓缩的，（以前师兄是这么做的）不过关于超离浓缩的破坏力至今还没有多大的概念。
转座载体的构建是没有问题的，因为先前在sf21细胞上是有表达的，但介于蛋白比较大故表达量也上不去。
另外请问氯霉素有什么副作用吗？是基于什么原因改用了呢？用与不用会有很大的差异吗？
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wangyongmei 发表于 2010-8-5 20:04 ：你好！我查了一下相关氟苯尼考胶囊的东西，发现大都卖的是大包装的粉剂，没有看到有厂家卖胶囊哦，请问stare024 是在哪里买的呢？？谢谢！

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