全基因组测序在临床感染疾病研究中的应用

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感染病分子诊断中，PCR是公认的首选技术。然而全基因组测序（WGS）可能会超越PCR成为首选。在今年举行的欧洲临床微生物学和感染病大会（ECCMID）上，关于该技术的科学研究展示数量迅速增长，正好证明了这一点。

大会上研究人员从多个方面探讨了WGS在临床中的应用，包括帮助预测耐药性，促进流感疫苗研发并对个体患者的流感严重性提出新假说，诊断和建立肺结核耐药性资料等。

利用WGS预测耐药性

来自亚特兰大埃默里大学的Tim Read在报告中谈到，他们课题组在研究将WGS作为一种常规临床工具，用于抗生素耐药性检测。

Read表示，分子方法例如核苷酸扩增检测出现之前，费时费力的细菌培养方法一直是抗生素耐药性分析的主要技术。分子检测快速、灵敏，而且适用于培养样本和临床样本，但是也常常存在特异性问题，只能提供有限的信息。

而WGS是无偏差的、全面的且可归档的。WGS能够分析一个生物体99%的基因组成，且容易存储数据并在需要时回头查看。一次基因组测序可以替代多种基因检测，例如毒素检测、耐药性检测和基因分型。WGS还能检测到一些我们没有关注的东西。

Read和他在埃默里大学的同事们一直在研究把WGS作为一种常规工具，检测万古霉素中介金黄色葡萄球菌（VISA），VISA是复杂的耐药菌的一个代表，它是由于长期万古霉素治疗引起的细菌进化，包含了多个染色体突变。

具体地说，研究人员一直在尝试对与基因型匹配的菌株进行测序，并进行全基因组关联分析（GWAS），以研发VISA的基因组预测软件。他们假设，因为VISA表型非常罕见，引发这些表型的突变肯定在金黄色葡萄球菌中也是罕见的。

在研究中，他们主要关注候选耐药性基因，并利用当时可用的公共数据库中3,277个金黄色葡萄球菌基因组。为了建立分类工具，他们使用了翔实表型中的已知突变和罕见突变，专注于26个候选SNP，然后把分类工具应用到一组含有28个菌株的测试组中，预测VISA的准确率达到89%。

Read说，为了提高检测的准确度，整个团队现在需要对足够多的实验室分离突变株进行测序，充分覆盖最常见的非同义突变。他说，“我们真的必须尽可能多的进行测序，而且现在测序也变得更便宜了。”

Read总结说，鉴于有竞争力的技术平台和监管机构的支持，常规临床菌株基因组测序有可能成为临床微生物学的研究主力。他说，“我们将会进行更多研究，例如特殊抗生素耐药性预测和大型菌株集的分类工具开发。利用基因组数据已经可以高精度地识别多种抗生素耐药性表型，很多人将全力以赴地创建预测工具。最终我们可能仅利用基于测序的检测就能够预测某种抗生素耐药性的表型。”

然而，Read承认，WGS目前还无法被广泛地应用到这方面，直到它达到现有分子检测例如PCR检测的一系列参数指标。具体来说，它必须便宜（每个基因组测序10美元）、快速（周期不超过一小时）、灵活（一次可运行一个或数百个基因组测序）以及精确（这一点已经被证明）。

到目前为止，测序平台，例如PacBio RSII、Illumina MiSeq以及Oxford Nanopore MinIon，都展现出了极大的应用前景，但是这些还不够。Read说，“你可以不同意这种说法，但这些技术目前确实无法满足临床实验室日常使用的需求。”

他补充道，“我们还需要考虑如何管理所有数据。即使普遍的观点是，我们都要淹没在海量的数据中了，但在我看来，我们拥有的数据还不够。”

利用WGS对抗流感

在另一个报告中，英国公共卫生部门（PHE）参考微生物学主任Maria Zambon讨论了WGS是如何成为了一种非常有用的工具，除了可以进行流感分子流行病学分析，还可以用来研发流感病毒疫苗。

Zambon说，过去30年她一直在研究流感，病毒检测工具发生了巨大改变，从低灵敏度的荧光检测发展为金标准的qPCR，如今又有了WGS分析，金标准的qPCR或将被WGS取代。她表示，这将改变病毒学检测的工作流程。以前，大多数实验室都是用实验室培养的方法，90年代至2005年期间演变成PCR和培养结合的方法；从2005年到2014年，分析方法演变成了先进行PCR检测，部分再进行WGS分析；2014年以后，WGS分析开始应用于所有PCR阳性样本检测，然后再挑选变异株进行培养。

她预测，大部分实验室最终将会把WGS分析作为首选，从测序中检测差异性足够大的变异，培养这些病毒。

她在PHE的实验室已经采用基于Sanger的WGS分析技术好几年了，并且证明了这种方法在一些典型的流感爆发中非常有用。首先，在2003年和2004年出现了一波致死的儿童流感病例，PHE用WGS技术对这些病例进行分析，发现了一些惊人的信息。例如，病毒分布在所有的遗传谱系中，致死病例与轻微的对照病例的基因相似，而且没有基因变异与致死结果完全相关。

PHE还利用WGS对英国分别发生在2009年和2010年的两次流行性感冒进行分析，发现这两次的流感致死病例并没有任何遗传差异。

这两个结果和其他类似的WGS研究使她们得出下列结论，患者特异的遗传因素决定了疾病的易感性，这个发现也成为了未来研究中的一个重要领域。

Zambon说，她的实验室目前正在由基于Sanger的WGS向NGS技术转变。“使用Sanger测序，基因组的覆盖率相对较低，而NGS测序的覆盖度高，但去同步化是错误的主要来源。在很多方面，NGS流程的搭建与Sanger并没有太大不同。”

Zambon还谈论了市场上用于WGS的所有主要NGS平台，她认为，不同的测序平台会有不同的系统误差，这些误差来源于使用的化学试剂。“我们期望有一种具有长读长和低错误率的测序系统。一旦达到这些要求后，就没有更好和更差技术之分。我们需要更加关注一些特殊的应用。”

目前她的实验室正在使用WGS数据为疫苗推荐提供相关信息，因为她们注意到，除了典型的抗原分析，它还可以提供另一种有用信息。她说，“如果想快速地进行血凝素测序分析或全基因组测序分析，需要创建有效的工作流程，并且确保能够得到信息构建完整的数据库。”

Zambon说，对于这种应用，WGS已经开始体现它的价值了，但是同时也存在着一些挑战。例如，在2014/2015年的流感季，抗原分析表明，当季的疫苗与流感病株非常匹配，但结果证明这些疫苗的有效性非常低。WGS显示，表型和基因数据间存在错配情况。

她认为，“利用WGS，我们可以得到更加全面的信息，事实上我们也开始把关注的焦点由单个基因片段转向全基因组，但是要实现这种模式的转变仍然存在一些挑战，其中一点就是，我们必须将表型和基因组数据关联起来。我们已经开始采用一种无偏差的分析方法，但是数据仍然是一个瓶颈。”


来源：测序中国