HBV血清标志物ELISA检测法中的钩状效应

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在我国人群中，乙肝病毒感染率很高，乙肝患者和无症状携带者估计在1.2亿人以上。因此乙肝标志物的检测除用于门诊及住院患者检测外，还运用于献血员的筛查、血液制品检验、婚前检查、围产期保健、幼儿入托、招工、升学、征兵及其他各类人员和特种行业的健康体检、乙肝预防免疫监测、医院感染监测和流行病学调查等方面，应用十分广泛，检测频度很高。

可是检测质量是一个值得注意的问题。其中因“钩状效应”造成的检测错误是不可忽视的。目前，HBV血清标志物检测多采用酶联免疫吸附(ELISA)法，冈其兼有荧光免疫(FIA)和放射免疫(RIA)技术的优点(特异性强、快速、灵敏)，又无两者的许多缺点，故能迅速推广普及。但由于因“钩状效应现象”(亦称带现象)导致假阴性的情况，文献中时有报道，但并未完全引起普遍重视。本院于1997年至2007年也曾发现6例，均表现为HBsAg阴性而HBeAg和HBcAb为阳性的反常现象，血清样本经稀释后复测，HBsAg均呈阳性。由于此种假阴性的HBsAg含量甚高，且多为病毒复制期，有较强的传染性，故应引起检验者和临床医生高度重视。

1 钩状效应(后带现象)发生率

各学者报道HBsAg检测钩状效应所致假阴性情况在ELISA反应中也确实存在钩状效应中的“后带现象”以致造成假阴性。而且有的学者报道发生率甚高。


2 什么是钩状效应

我们知道抗原抗体反应除需有适合的电解质、PH和温度外，抗原抗体比例适合也很重要。血清免疫学中的“带现象”，早在1929年分别由Shibley和Hedberger提出。此后研究者甚多，其机理尚未完全清楚，但认为主要原因是抗原抗体间比例不适而发生的抑制反应，因抗体过剩而发生抑制反应称前带现象；因抗原过剩而发生抑制反应称“后带现象”，统称“带现象”。以沉淀反应为例，学者们根据试验得到关系图1：


在免疫学试验中，恒定量的抗体(或抗原)中加入递增量的抗原(或抗体)形成抗原抗体复合物(沉淀)，曲线高峰部分是抗原抗体比例最适范围，称等价带。在等价带前因抗原量少，抗体相对含量高为抗体过剩带，等价带后抗体相对含量低为抗原过剩带。无论是抗原过剩还是抗体过剩，都会使反应信号弱化。当抗原抗体极度过剩时，则无沉淀形成，反应呈阴性。使反应信号(IC量)一(抗原抗体相对浓度)呈一条钩状曲线。1977年Green等根据曲线形状，提出“钩状效应”(Hook effect)这个名称，它概括了前带和后带现象，在命名上较为确切。

钩状效应不仅出现在抗原抗体的沉淀反应中，其他血清免疫反应也可出现，如：(1)凝集反应：如肥达、布氏杆菌凝集反应、早孕试验、CRP试验。(2)反相血凝试验：如HBsAg等。(3)酶联免疫试验：如HBV标志物、HIV、TP、AFP中都可出现。

3 ELISA法钩状效应产生的原因

“钩状效应”的产生，与方法学关系密切。ELISA法是检测HBV标志物的方法，有一步法和二步法之分。前者易发生钩状效应，后者则较少见。

3.1 二步法 灵敏度高，假阴性较少。但速度慢，步骤多，检验人员不愿采用。

1)固相抗体加标本(含抗原)保温反应，形成固相抗体抗原复合物；

2)洗涤除去过量的抗原；

3)加酶标抗体与固相抗体抗原复合物结合形成抗体—抗原一酶标抗体夹心复合物；

4)彻底洗去未结合的多余酶标抗体；

5)此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原量相关；

6)加底物，固相上的酶催化剂底物成有色产物。通过比色测出标本中抗原量。

3.2 一步法 敏感，快速，但有假阴性。

1)固相抗体加标本(含抗原)和酶标抗体，保温反应，形成固相抗体一抗原一酶标抗体夹心复合物；

2)洗涤未结合物质；

3)加底物，固相载体上酶催化底物而显色。

在一步法测定时，当强阳性过剩抗原分别同时和包被抗体及酶标抗体结合，并分别将包被的抗体及酶标抗体上的结合点饱和(或造成空间受阻)，以致于已和酶标抗体结合的抗原不能再和包被抗体结合，已和包被抗体结合的抗原不能再和酶标抗体结合，因而不能形成牢固的抗体一抗原一酶标抗体夹心复合物，洗涤时被除去，从而导致假阴性结果。据报道，含量10万ng／ml，几乎无一例不出现假阴性。

4 如何发现和处理钩状效应现象

钩状效应现象的5种模式HBsAg(一)而HBeAg(+)，是临床常见的一种模式；HBsAg(一)而HBeAg或抗-HBc(+)；HBsAg(一)而抗-HBe(+)；HBsAg和HBeAg阴性而抗-HBc(+)；HBsAg(一)而抗-HBe和／或抗-HBc(+)。若临床上检测结果出现HBsAg阴性而HBeAg阳性者，都应考虑有钩状现象的可能。这是因为：(1)HBeAg多与HBsAg同时存在，滴度基本平行；(2)HBeAg一般是在HBsAg出现之后出现，在它消失前消失。所以通常情况下，HBeAg是在HBsAg阳性血清中存在，因为当HBsAg阴性而HBeAg阳性时，可能是钩状效应引起的HBsAg假阴性。

对此可采用三种方法处理：

(1)将这种高滴度标本改用二步法测定；

(2)采用庞焕汉等报道的改良ELISA一步法，可避免假阴性结果的发生，操作如下：在加完血清后，将固相板快速转动30s，室温放置5min，(如批量检测可免计时)，然后将固相板孔中的血清弃掉(弃掉过剩的抗原，避免酶标抗体丢失)，其余操作步骤同原法，此法操作简便，既不失ELISA一步法的灵敏、省时，又不用稀释血清，一次检验符合率为100％，无假阴性和假阳性结果，是防止ELISA一步法检测HBsAg出现假阴性结果的简易实用方法；

(3)血清在原浓度的基础上，再增加16倍、64倍两个稀释度检测。

根据我们的体会，这样做可较有效地避免因乙肝标志物检测中钩状效应而造成的假阴性结果，从而提高了检测质量。

可见，若不注意识别和发现钩状效应所致的假阴性，将导致部分病毒复制期具有较强传染性的乙肝病人漏检，同时还提示，单凭HBsAg一项指标无从发现高滴度HBsAg血清样本是真阴性还是假阴性。目前高考、入托和某些单位健康体检，只检测HBsAg一项是不完备的，有可能漏检HBV病人或携带者。所以作为体检和临床病人，都应强调同时查HBV血清标志物(所谓“两对半”)较为合理。