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发表于 2015-1-31 20:04:10
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九、后续工作. J0 s' s: \1 L4 {+ w7 S% K2 j
8 X& M0 ~1 e# b% m$ }克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆,可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞;所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开,就需要克隆化。克隆化的原则是,对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。
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(一) 克隆化方案/ ]8 h' P: b. m( k' w
用克隆化的方法很多,而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。$ v4 ?# Q% p: f8 f
1. 有限稀释法的程序0 V( s A* @7 `3 H- L
① 制备饲养细胞悬液(同融合前准备)
3 k& G& F; w6 d4 H, n$ _ ② 阳性孔细胞的计数,并调细胞数在1~5×103/ml. u5 u# _1 q4 i% |, K1 P
③ 取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液,即20个细胞/ml,100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个/ml,100μl/孔加D、E、F三排,为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml 含饲养细胞的完全培养液,细胞数5个/ml,100μl/孔,加G、H两排,为每孔0.5个细胞。8 ]! P+ ?7 n! i. C; G! J
④ 培养4~5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆,补加完全培养液200μl/孔。$ j$ w9 m2 _+ ]; p0 u4 t' g3 J
⑤ 第8~9天时,肉眼可见细胞克隆,及时进行抗体检测。. L( d! r9 t0 r5 `7 H2 m
注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。
5 ? q/ m1 G* t4 G2 r0 N9 I9 y) a 2. 软琼脂法
; `7 c# ?8 [2 ]! Y# n2 W3 m ① 软琼脂的配制
/ ~8 {) Z t1 ~ 含20%FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640
& E1 s' U' ~% f0 A1 k' P% y 1%琼脂水溶液:高压灭菌,42℃预热。
% e6 o' ~ q. k 0.5%琼脂:由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。
2 {2 C1 K% G1 p; N0 c# ]7 ]+ a ② 用上述0.5%琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。; t0 p: @1 d7 o2 R2 w5 d
③ 按100/ml,500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。) d+ p. A [0 X8 {' O
④ 1ml 0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。' Z- t1 |( `/ S8 h, j2 P
⑤ 混匀后立即倾注于琼脂基底层上,在室温中10分钟,使其凝固,孵育于37℃,5%CO2孵箱中。
]; n6 ] F! Y0 L* y6 H. b" ^ ⑥ 4~5天后即可见针尖大小白色克隆,7~10天后,直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。+ e! ^+ E: ]; h& p- ?
⑦ 检测抗体,扩大培养,必要时再克隆化。7 m; n. k0 X/ q/ v% Y
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(二) 杂交瘤细胞的冻存6 P. U% k' R1 ~- k4 }8 J; O
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及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候,细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存,则因为上述的意外而全功尽弃。
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# Y6 x9 V- @# t# e4 g& S 杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样,原则上细胞应在每个冻存管中含1×106以上,但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变,在24孔培养板中培养,当长满孔底时,一孔就可以冻一管。* I( p( V% e7 q* d: ]. J
细胞冻存液:
; @4 a) H/ ]+ j' I( Y 50%小牛血清
) F' ^$ a, [5 @( k" t8 ~- k 40%不完全培养液: E+ Q7 I7 ]. H
10% DMSO(二甲亚砜)
5 L; O9 o% ?7 [ 冻存液最好预冷,操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃,再降温时一般按每分钟降温2~3℃,待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃ 后放-70℃超低温冰箱,次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。 |
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