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发表于 2015-1-31 20:04:10
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九、后续工作
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克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆,可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞;所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开,就需要克隆化。克隆化的原则是,对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。
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(一) 克隆化方案
% w: k9 G* _+ r5 \* L 用克隆化的方法很多,而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。# Z t6 v9 o# l9 P
1. 有限稀释法的程序$ M" x, `6 M7 ^ M# B* q+ X% u
① 制备饲养细胞悬液(同融合前准备)- F% N% o4 U: D' p- Q
② 阳性孔细胞的计数,并调细胞数在1~5×103/ml3 d+ q1 \' w n5 l9 }$ O! n
③ 取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液,即20个细胞/ml,100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个/ml,100μl/孔加D、E、F三排,为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml 含饲养细胞的完全培养液,细胞数5个/ml,100μl/孔,加G、H两排,为每孔0.5个细胞。8 R& f6 ], f2 O/ w4 I
④ 培养4~5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆,补加完全培养液200μl/孔。- j0 H, j# {1 Y$ o) r
⑤ 第8~9天时,肉眼可见细胞克隆,及时进行抗体检测。) Z: ]9 W6 C2 A J
注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。5 x7 Z. p& H2 b6 l ]9 `- ?
2. 软琼脂法
; o, M3 d d" _5 { ① 软琼脂的配制& f" \- P8 r1 {$ N6 \
含20%FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640
' \ g" g7 s5 Y( [, o 1%琼脂水溶液:高压灭菌,42℃预热。# R/ |9 D% P' r+ u, I3 L! L
0.5%琼脂:由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。
' R+ P7 u. \" H9 q ② 用上述0.5%琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。6 W8 {! {6 W- a( i' z
③ 按100/ml,500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。3 A) c; S; N, {& T/ }
④ 1ml 0.5%琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。. ~4 E" n* w' ^4 f- c) m7 `( j
⑤ 混匀后立即倾注于琼脂基底层上,在室温中10分钟,使其凝固,孵育于37℃,5%CO2孵箱中。
5 x( M& s# s8 R: a/ W" d ⑥ 4~5天后即可见针尖大小白色克隆,7~10天后,直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。- Q1 q3 \( V+ t) ]
⑦ 检测抗体,扩大培养,必要时再克隆化。- L+ q' e" Y7 G; X0 O; U& U
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(二) 杂交瘤细胞的冻存' _. P8 q! Z3 w) s8 v$ a/ _
2 `" [! R+ y$ v# K; R# r( ?! ~ 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候,细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存,则因为上述的意外而全功尽弃。
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杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样,原则上细胞应在每个冻存管中含1×106以上,但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变,在24孔培养板中培养,当长满孔底时,一孔就可以冻一管。
! Z$ k# C; V: i1 { 细胞冻存液:
' e: s6 s b" A' q& [1 |* w, o0 G 50%小牛血清
& [0 | D( A& l9 ?5 |/ ` 40%不完全培养液
- [/ [' l: G* R0 B/ H 10% DMSO(二甲亚砜)3 g. v- i4 J0 Z q
冻存液最好预冷,操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃,再降温时一般按每分钟降温2~3℃,待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃ 后放-70℃超低温冰箱,次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。 |
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