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标题:
叶绿素,SOD,MDA,POD,硝酸还原酶等测定方法
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作者:
jbclinnic
时间:
2015-7-21 16:04
标题:
叶绿素,SOD,MDA,POD,硝酸还原酶等测定方法
1 叶绿素含量测定:
80%的丙酮液的配制:4L丙酮 + 1L蒸馏水。
称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管(做三个重复),加入25ml浓度为80%的丙酮液,放在黑暗处浸提大约36小时后取出,稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm下测定光密度,以80%的丙酮液为空白。(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35~36)
也可用95%乙醇溶液,在665、649、470nm处有最大吸收峰
Ca=13.95D665-6.88D649
Cb=24.96D649-7.32D665
Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/245
2 抗氧化酶活性的定:(2.5g样)
0.05mol/L磷酸缓冲溶液 (PBS)(pH=7.8)溶液的配制:65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O, 定容到4L。(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P134)。
取低温保存的鲜样,称2g左右的叶片(或根)放在50ml的离心管,加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液(pH=7.8)(最好是较冷的磷酸缓冲溶液,防止研磨时温度过高使酶失活),研磨(用磨碎机磨),8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟,上清液为粗酶液。
2.1丙二醛(MDA)的测定:
20%三氯乙酸(TCA)溶液的配制:称200g三氯乙酸,用蒸馏水定容到1000ml。(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124);
0.5% 硫代巴比妥酸(TBA)溶液的配制:称5g硫代巴比妥酸(TBA),用20%三氯乙酸(TCA)溶液溶解并定容到1000ml。(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124)(先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解);
0.5ml酶液(对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液)(做三个重复)+ 3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却(至少30min)――比色(OD600、OD532、OD450)。(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124)
2.2超氧化物歧化酶(SOD)的测定:
NBT(400ml)混合反应液:
392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液
(100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素)。
(另配)100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na
测试时:取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02 ml(叶)粗酶液,于光照培养箱中6-10分钟,OD650下测定吸光度。
2.3过氧化物酶(POD)的测定:
0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)(pH=7.0)溶液的配制:10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975g NaH2PO4·2H2O,定容到1000ml。
0.3%H2O2溶液的配制:吸2.5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。
0.2%愈创木酚溶液的配制:称0.5g愈创木酚,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。
2ml 0.3%H2O2溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS) + 0.02ml??(原来为0.01)酶液(根加0.05ml酶液)(对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液)(做三个重复),记录470nm处OD降低速度。将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121)
比色时加酶液,混合后即刻计时。
2.4 脯氨酸的测定
标准曲线的制作:
编号
1
2
3
4
5
6
7
标准脯氨酸的量(ml)
0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
H2O(ml)
1.0
0.9
0.8
0.6
0.4
0.2
0
冰乙酸(ml)
2
2
2
2
2
2
2
显色液(ml)
3
3
3
3
3
3
3
脯氨酸含量(µl)
0
1
2
4
6
8
10
0.5ml酶液(对照用0.5ml 80%乙醇代替)(做三个重复) + 1ml冰乙酸 + 1.5ml显色液―――混匀,沸水浴15min,冷却后测OD520。
2.5可溶性蛋白的测定(参考赵志杰,史国安,董新纯编的《植物生理学实验指导》)
牛血清白蛋白:配成100µg/ml和1000µg/ml。
90%乙醇:90ml乙醇 + 10ml蒸馏水。???
85%(W/V)磷酸:170ml磷酸 + 30ml蒸馏水。
考马斯亮蓝G-250:称0.2g考马斯亮蓝G-250溶于100ml 90%乙醇中,加入85%(W/V)磷酸200ml,用蒸馏水定容到2L。常温下可保存一个月。
标准曲线的制作:
配制0~100µg/ml血清白蛋白血液
管号
1
2
3
4
5
6
100µg/ml牛血清白蛋白(ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水量(ml)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
蛋白质含量(ml)
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
配制0~1000µg/ml血清白蛋白血液
管号
7
8
9
10
11
12
100µg/ml牛血清白蛋白(ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水量(ml)
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
蛋白质含量(ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0.1ml 酶液(做三个重复) + 5ml考马斯亮蓝G-250―――混匀,放置2min后在595nm下比色。
2.6过氧化氢酶(CAT)的测定:
0.3%H2O2溶液的配制:吸5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到500ml。
1 ml 0.3%H2O2溶液 + 1.9ml H2O + 0.1 ml 酶液,测定240nm处OD降低速度。将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位。(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P121)
2.7 抗坏血酸(ASA)的测定:(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P125)
5% 三氯乙酸(TCA)溶液的配制:25g三氯乙酸,用蒸馏水定容到500ml。
10% 三氯乙酸(TCA)溶液的配制:25g三氯乙酸,用蒸馏水定容到250ml。
150mmol/L NaH2PO4(pH 7.4)溶液的配制:100ml。
44% H3PO4溶液的配制:250ml。
4% 2,2-二联吡啶溶液的配制:250ml。
3% FeCl3溶液的配制:100ml。
首先标制作准曲线。
粗酶液的提取:取低温保存的鲜样,称0.5g左右的叶片(或根)放在50ml的离心管,加入15m 5%三氯乙酸(TCA)溶液(最好是较冷的三氯乙酸(TCA)溶液,防止研磨时温度过高使酶失活),研磨(用磨碎机磨),15000r/min的冷冻离心机下离心10分钟,上清液为粗酶液,用于抗坏血酸(ASA)含量的测定。(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125~126)
测定:0.2ml 粗酶液 + 0.2ml 150mmol/L NaH2PO4(pH 7.4)溶液 + 0.2ml H2O,混匀(振荡),至少30秒后,再依次分别加入:0.4 ml 10%三氯乙酸(TCA)溶液 + 0.4 ml 44% H3PO4溶液 + 0.4 ml 4% 2,2-二联吡啶溶液 + 0.2ml 3% FeCl3溶液,混合后在37℃水浴中保温60min,测定OD525处的值。(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》P125~126)
2.8 谷胱甘肽的测定:
4g新鲜材料 + 2ml 0.3mol/L醋酸汞 + 2ml 30%醋酸钠后研磨匀浆,转移到离心管中,以蒸馏水冲洗残渣,并以玻璃棒搅拌,净置10min,使之充分沉淀,离心后弃去上清液,沉淀以水(每次10ml)在摇动情况下冲洗2次。向沉淀中加入10ml 1mol/L盐酸以溶解其中的谷胱甘肽,以玻璃棒搅拌5min后加入1ml 20%的碘化钾溶液,混匀,离心。上清液转入供滴定用的100ml玻璃管中,沉淀在搅动情况下以10ml水冲洗。离心后溶液与第一次离心液合并。向得到的溶液中加入0.5ml淀粉液,用1mmol/L KIO3滴定,直至出现不消失的蓝色为止。1ml 1 mmol/L 的KIO3相当于0.307mg谷胱甘肽。(参考《现代植物生理学实验指南》,中国科学院上海植物生理研究所编)。
2.9天冬酰胺合成酶(AS)的测定:
2.10 天冬酰胺转氨酶(AspAT)的测定:
3 硝酸还原酶(NR)的测定采用离体法:(1g样)(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P27~29)
亚硝酸钠标准溶液(1µg/ml):称NaNO2 0.9857g ,定容到1000ml,再吸5ml定容到1000ml。
0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液:30.0905g Na2HPO4·12H2O + 2.4965g NaH2PO4·2H2O,加蒸馏水定容到1000ml。
3mol/L HCl:125ml浓盐酸加蒸馏水定容到500ml。
1% 磺胺溶液:5.0g磺胺溶于500ml 3mol/L HCl中。
0.2% a-萘胺溶液:1.0g a-萘胺溶于125ml冰醋酸后用蒸馏水定容到500ml,贮于棕色瓶中。
0.1mol/L KNO3溶液:5.055g KNO3溶于500mln 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液。
0.025mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液:Na2HPO4·12H2O 8.8640g + NaH2PO4·2H2O 0.0570g,加蒸馏水定容到1L。
提取缓冲液:1.211g半胱氨酸 + 0.372g EDTA,溶于1L 0.025 mol/L pH8.7的磷酸缓冲溶液。
2mg/ml NADH 溶液:0.5g NADH溶于250ml 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液(临用前配制)。
首先标制作准曲线:
取7支洁净烘干的15ml刻度试管加试剂,即配成0~2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在30℃保温箱或恒温水浴中保温30min,然后在540nm波长下比色。以亚硝态氮(μg)为横坐标(x),光密度值为纵坐标(y)绘标准曲线或建立回归方程。
各试剂加入顺序
管 号
1
2
3
4
5
6
7
亚硝酸钠标准液(ml)
0
0.2
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸馏水(ml)
2.0
1.8
1.6
1.2
0.8
0.4
0
1% 磺胺溶液(ml)
4
4
4
4
4
4
4
0.2%α-萘胺(ml)
4
4
4
4
4
4
4
每管含NO2- (μg)
0
0.2
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
1g 材料+15ml提取缓冲液后研磨匀浆,转移到离心管中于4℃、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液,用于硝酸还原酶(NR)的测定。
0.4ml+1.2ml 0.1mol/L KNO3溶液 + 0.4mlNADH溶液后混匀(对照不加NADH溶液,而以0.4ml 0.1mol/L pH 7.5磷酸缓冲液代替),在25℃水浴中保温30min。保温结束后立即加入1ml磺胺溶液终止酶反应,再加1ml 0.2% a-萘胺溶液,显色反应15min后于4000r/min下离心5min,取上清液在540nm下比色测定吸光度。根据回归方程计算。
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